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多能干细胞冻存和复苏方法

干细胞冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环,但是干细胞不同于普通细胞系,其增殖扩增过程中需要聚团生长,为保持其细胞活性,不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法,不能很好的保持细胞活性,且复苏细胞成活率较低。这次就重点介绍干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。

本方法适用于HAKATA 人间充质干细胞无血清培养基以及HAKATA 无血清细胞冻存液培养的细胞(同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞),冻存以及复苏前后,应当使用同一种培养基,复苏传代后可以更换其他培养体系。

HAKATA 无血清细胞冻存液是一款化学成分确定,无血清,无动物源成分,且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下:

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1、冻存:以下操作方法以6孔板为例:

注意:如果使用mFreSR,请将所需量的mFreSR融化并置于冰上。

(1) HAKATA 无血清细胞冻存液为即拿即用,且4℃保存,冻存液拿出后应快速放回4℃;

(2)使用干细胞消化液消化细胞;

(3)收集细胞,室温300×g离心5分钟;

(3)小心吸掉上清液,不要干扰细胞团;

(4)用1ml冻存液重悬细胞,并均匀分装到冻存管中

采用非程序降温法,将冻存管直接放入-80℃冰箱中,冻存24h后转移至液氮中长期保存。

2、解冻

预先包被细胞培养板,人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

(1)干细胞培养基室温平衡15-30min,不能37℃加热;

(2)在水浴锅中持续晃动冻存管,37℃水浴锅中快速解冻细胞,直至细胞完全融化;

(3)取出冻存管,用70%乙醇擦拭冻存管表面;

(4)准备15ml离心管,预先加入5mL干细胞培养基,将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中,尽量保持细胞聚团状态。

(5)在室温300×g离心5分钟。

(6)吸掉上清,注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次,不要破坏细胞聚团状态。

(7)分别取0.5mL细胞悬液,均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中,并分别补充多能干细胞培养基至2m。

(8)置于37°C细胞培养箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次,以均匀分散细胞。

(9)每天更换培养基,并显微镜下观察细胞状。

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